1. Introdução
O impacto do envelhecimento na aparência e função da pele tem recebido atenção crescente nas últimas décadas. É amplamente aceito que o envelhecimento da pele se distingue em envelhecimento cutâneo cronológico e fotoenvelhecimento da pele . O fotoenvelhecimento cutâneo é causado pela radiação solar e é comum na pele exposta à luz solar, especialmente na face . Portanto, o fotoenvelhecimento da pele pode ser evitado ou diminuído pela foto-proteção. Os sinais clínicos comuns da pele fotoenvelhecida incluem rugas profundas e grosseiras, secura, falta de firmeza e flacidez. Em contraste, o envelhecimento cronológico da pele é causado pela passagem do tempo e ocorre o tempo todo na pele de todo o corpo, incluindo a pele do rosto. A pele cronologicamente envelhecida é caracterizada por enrugamento fino e flacidez . O envelhecimento cronológico da pele é responsável por grande parte do envelhecimento da pele e é mais comum do que o fotoenvelhecimento cutâneo em indivíduos de pele escura e em mulheres . Considera-se que uma aparência jovem desempenha um papel importante na manutenção da auto-estima e das relações sociais . Portanto, há uma crescente demanda por intervenções antienvelhecimento para retardar ou mesmo reverter os sinais de envelhecimento da pele.
O uso de suplementos dietéticos para melhorar a aparência e função da pele envelhecida tem recebido crescente atenção. Muitos componentes dietéticos, como polifenóis , vitamina, ácidos graxos, oligoelementos e proteínas relataram exercer efeitos benéficos sobre a pele envelhecida e têm sido utilizados como nutracêuticos ou alimentos funcionais em muitos países e regiões. Recentemente, os pesquisadores prestaram muita atenção aos hidrolisados protéicos como potenciais suplementos dietéticos. O colágeno é a principal proteína estrutural dos diferentes tecidos conjuntivos, como pele, osso, cartilagem e tendões, e tem sido amplamente utilizado nas indústrias de medicamentos e alimentos. Os peptídeos de colágeno (CPs) são o produto enzimólise do colágeno ou da gelatina e são utilizados como importantes componentes ativos devido às suas diversas bioatividades, alta biodisponibilidade e boa biocompatibilidade. Vários estudos demonstraram os efeitos benéficos da ingestão de CPs no fotoenvelhecimento da pele. A administração oral de CPs da pele de peixe teve óbvios efeitos protetores sobre o fotoenvelhecimento da pele, incluindo a melhora da capacidade de retenção de umidade, o reparo das fibras de proteína de colágeno e elastina endógenas . Além disso, ensaios clínicos também demonstraram que os efeitos benéficos da ingestão de CPs na pele do rosto, incluindo a melhora da elasticidade da pele facial, reduzem o ressecamento e as rugas da pele e aumentam o conteúdo de colágeno na derme cutânea . No entanto, pouco trabalho foi realizado para avaliar os efeitos da ingestão de CPs em pele envelhecida cronologicamente.
O osso bovino é o principal subproduto da indústria de processamento bovino e tem sido amplamente utilizado como matéria-prima para a obtenção de gelatina de alta qualidade . Embora haja algumas preocupações com a doença da vaca louca na Europa e nos Estados Unidos, o osso bovino ainda é uma das fontes mais abundantes de gelatina e responde por 23,1% da produção de gelatina . Portanto, o osso bovino é uma matéria-prima abundante e de alta qualidade usada para preparar CPs. O efeito biológico dos CPs do osso bovino está concentrado principalmente no seu efeito benéfico no metabolismo ósseo, incluindo a inibição da perda óssea e a melhora da osteoartrite . No entanto, existe um conhecimento limitado sobre o efeito de CPs do osso bovino no envelhecimento da pele. Portanto, a preparação de CPs a partir do osso bovino e a avaliação adicional do seu efeito sobre o envelhecimento da pele é uma boa maneira de utilizar os subprodutos para uma vantagem econômica e ambiental.
As actividades funcionais dos hidrolisados ou péptidos derivados de proteínas são grandemente afectadas pela sua estrutura molecular e peso, que são altamente afectadas pelas suas condições de processamento e especialmente pela especificidade enzimática . A alcalase é uma protease comum e amplamente utilizada para preparar hidrolisados ou peptídeos de proteínas. É uma endoprotease típica e preferencialmente cliva sítios contendo resíduos hidrofóbicos, como Ala, Leu, Val e Phe. A colagenase bacteriana é uma protease que hidrolisa o colágeno. Tem uma preferência pela ligação X-Gly (X é normalmente um aminoácido neutro) da sequência de repetição -Gly-Pro-X-Gly-Pro-X- na molécula de colagénio. A colagenase tem uma grande promessa na indústria de processamento de colágeno. Considerando a especificidade enzimática, a estrutura molecular ou seqüências de peptídeos produzidos por estas duas enzimas podem ser diferentes, o que pode impactar grandemente seus efeitos na pele envelhecida cronologicamente.
O objetivo do presente estudo é investigar os efeitos de CPs do osso bovino no envelhecimento cutâneo baseado no modelo de envelhecimento cronológico. O osso bovino foi empregado como matéria-prima para preparar diferentes CPs usando alcalase e colagenase. Em seguida, os efeitos de CPs de osso bovino em pele envelhecida cronologicamente foram investigados em camundongos cronologicamente envelhecidos, analisando-se a histologia da pele, componentes da pele e indicadores antioxidantes. Os resultados mostraram que a administração oral de CPs do osso bovino tem efeitos benéficos na pele envelhecida cronologicamente, melhorando a flacidez da pele, mas não houve retenção da umidade na pele. Os CPs preparados pela Alcalase tiveram um desempenho melhor do que os CPs preparados pela colagenase.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais e Químicos
A Alcalase foi comprada da Novozymes (Pequim, China). Prolina (grau alimentício) e colagenase bacteriana foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) foi adquirido da Beijing Solarbio Ciência e Tecnologia Co., Ltd. (Pequim, China). Kits comerciais utilizados para a determinação de hidroxiprolina (Hyp), colágeno tipo I e tipo III, ácido hialurônico (HA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e malondialdeído (MDA) foram adquiridos da Jiancheng Inst. de Biotecnologia (Nanjing, China). Todos os outros produtos químicos utilizados no estudo foram de grau analítico ou melhor.
2.2. Preparação de Peptídeos de Colágeno (CPs)
A gelatina foi extraída do osso bovino com água quente. Resumidamente, o osso bovino foi tratado em água fervente por 6 h, seguido por remoção do osso usando filtro de gaze. O filtrado foi arrefecido, desengordurado e centrifugado a 4500 x g durante 15 min com uma centrífuga refrigerada (TGL-185, Pingfan Co., Ltd., Changsha, China). Após a centrifugação, as frações solúveis superiores foram coletadas e liofilizadas para obter a gelatina. A gelatina foi enzimaticamente hidrolisada pela Alcalase em pH 8,0 por 4,0 h para obter peptídeos de colágeno (denominados ACP) e a colagenase em pH 7,5 por 3,0 h para obter peptídeos de colágeno (denominados CCP). Finalmente, os hidrolisados foram dialisados para eliminar sal e aminoácidos livres, liofilizados e armazenados a -80 ° C até serem utilizados.
2.3. Distribuição de Peso Molecular
A distribui�o do peso molecular dos CPs foi medida utilizando um sistema de cromatografia l�uida de alto desempenho Shimadzu LC-15C (HPLC) (Shimadzu, Tóquio, Jap�) equipado com uma coluna TSK gel G2000 SWXL (7,8 x 300 mm, Tosoh, Tóquio, Jap�). As amostras foram carregadas na coluna e eluas com acetonitrilo a 45% ( v / v ) contendo ido trifluoroacico a 0,1% ( v / v ) a um caudal de 0,5 mL / min e monitorizadas a 214 nm temperatura ambiente. Uma curva de calibração do peso molecular ( y = -0,1881 x + 6,5867, y : log MW, x : tempo, R 2= 0,9994) foi obtido a partir dos tempos médios de retenção dos seguintes padrões: Gly-Ser (146 Da), Asn-Cys-Ser (322 Da), Trp-Pro-Trp-Trp (674 Da), bacitracina (1423 Da) e aprotinina (6512 Da) [ 15 ].
2.4. Composição de Aminoácidos
As amostras foram hidrolisadas em HCl 6,0 M a 110 ° C durante 24 h. Após a reação de derivatização do fenisisotiocianato (PITC), a composição de aminoácidos foi analisada por um sistema de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) Shimadzu LC-15C (Shimadzu, Tóquio, Japão) equipado com coluna reversa Zorbax SB-C18 (4,6 × 250 mm, Agilent, Santa Clara, CA, EUA). A fase móvel consistiu em (A) solução tampão fosfato 10 mM (pH 6,9) e (B) 100% acetonitrilo e o caudal foi de 1,0 mL / min. O gradiente foi programado da seguinte forma: 0-5 min, 5-10% B; 5 a 25 min, 10 a 17% de B; 25 a 45 min, 17 a 35% B; 45 a 48 min, 35 a 100% B; 48 a 50 min, 100% de B; 50 a 58 min, 100 a 5% de B; e 58-60 min, 5% B. O comprimento de onda de detec�o foi estabelecido em 254 nm .
2.5. Animais, dietas e tratamentos
Os experimentos em animais foram realizados sob os protocolos aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Pequim e seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (publicação NIH No. 86-23, revisada em 1996). O presente experimento foi aprovado pelo Animal Experimental Welfare & Ethical Inspection Committee, o Centro de Supervisão, Inspeção e Ensaios de Organismos Geneticamente Modificados, Ministério da Agricultura (Beijing, China), e foi realizado no Centro de Animais Experimental, Centro de Supervisão e Testes para OGM Food Safety, Ministério da Agricultura (SPF grau, Pequim, China).
Ratinhos fêmeas Kunming com dois meses de idade (ratinhos jovens, 28 ± 2 g, com grau patogénico específico (SPF)) e treze meses de idade (ratinhos velhos, 45 ± 5 g, grau SPF) foram adquiridos em Sibeifu (Pequim) Laboratório Animal Science and Technology Co., Ltd. (Pequim, China). Os ratinhos de dois meses de idade foram estabelecidos como controlos jovens ( n = 10) e foram administrados 0,2 mL de solução salina normal. Os camundongos de treze meses de idade foram divididos, com base no peso corporal, em 6 grupos ( n= 10 / grupo), incluindo o grupo de modelos e os grupos de tratamento de CPs. O grupo modelo recebeu 0,2 mL de solução salina normal; enquanto os grupos de tratamento CPs receberam 0,2 mL de ACP em doses de 200 (ACP-200), 400 (ACP-400) e 800 mg / kg de peso corporal (ACP-800), respectivamente, e 0,2 mL de CCP na dose de 400 mg / kg de peso corporal (ACP-400). Além do acesso livre à dieta e à água purificadas normais AIN-93M, cada grupo foi administrado intragastricamente com 0,2 mL de solução salina ou CPs normais uma vez ao dia durante oito semanas. Após oito semanas, os ratos foram sacrificados e as amostras foram coletadas para posterior tratamento e análise.
2.6. Medição do grau de frouxidão da pele (DSL)
Durante o período deste estudo, as costas dos camundongos foram depiladas com sulfeto de sódio a 6% ( p / p ) 2 dias antes de medir o grau de frouxidão da pele a cada vez. Resumidamente, a pele dorsal, a cerca de 1 cm de distância da raiz da cauda, foi suavemente esticada levemente pela mão esquerda com os membros posteriores dos camundongos do tampo da mesa. A mão direita controla o movimento do mouse puxando a cauda. O comprimento do alongamento foi medido imediatamente quando os ratos estavam imóveis. O DSL foi definido como a seguinte equação: DSL (mm) = comprimento do alongamento da pele dorsal.
2.7. Medição do Índice de Baço (SI) e Índice de Timo (TI)
Os ratos foram pesados e sacrificados. O baço e o timo foram retirados dos ratos e pesados imediatamente. O índice de baço (SI) e índice de timo (TI) foram calculados de acordo com a seguinte equação: SI ou TI (mg / g) = (peso do baço ou timo) / peso corporal.
2.8. Análise histológica
Após oito semanas, os camundongos foram sacrificados e amostras de pele dorsal foram dissecadas imediatamente. 4 amostras de pele (cerca de 1 cm 2 ) em cada grupo foram fixadas em solução de formalina neutra tamponada a 4% por 24 h e embebidas em parafina. Secções em série (7 μm) foram colocadas em lâminas revestidas de silano e coradas com hematoxilina-eosina (HE). As secções coradas foram posteriormente analisadas utilizando um microscópio óptico. Uma imagem representativa da secção da pele dorsal corada com HE em cada grupo foi apresentada em parte dos resultados.
2.9. Medição do teor de umidade
Os ratinhos foram depilados com sulfato de sódio a 6% ( p / p ) 2 dias antes de sacrificar os ratinhos. A pele dorsal foi coletada após o sacrifício dos camundongos e a umidade da pele foi medida imediatamente. O teor de umidade da amostra de pele foi determinado de acordo com GB / T5009.3-2010, um padrão nacional da China para medir o teor de umidade. Este método foi empregado para medir o teor de umidade da pele em vários relatórios anteriores . Resumidamente, cerca de 0,1 g de amostra de pele em pó foram colocados em frascos de pesagem e secos num forno a 105 ° C durante 4 horas. O teor de umidade foi calculado de acordo com a seguinte equação:
Teor de umidade = ( m 1 - m 2 ) / ( m 1 - m 3 ) × 100
(1)
m 1 , m 2 e m 3 é o peso da garrafa de pesagem mais a amostra de pele, a garrafa de pesagem mais a amostra de pele acabada a seco e a garrafa de pesagem, respectivamente.
2,10. Determinação do teor de ácido hialurônico (HA)
Cerca de 0,1 g de tecido da pele foram pulverizados num banho de azoto líquido e homogeneizados em solução salina de pré-arrefecimento. Após a centrifugação a 14.000 × gpor 15 min a 4 ° C com uma centrífuga refrigerada (TGL-185, Pingfan Co., Ltd., Changsha, China), o sobrenadante foi coletado para analisar o conteúdo de ácido hialurônico (AH) usando uma solução comercial. Kit de medição de HA (Nanjing Jiancheng Bio Inst., Nanjing, China).
2.11. Determinação do conteúdo de colágeno
Um kit de ensaio de hidroxiprolina comercial (Nanjing Jiancheng Bio Inst., Nanjing, China) foi usado para analisar o conteúdo de Hyp. Resumidamente, cerca de 0,05 g de tecido da pele foi totalmente hidrolisado, oxidado e reagido com dimetil-amino-benzaldeo. O produto final tem uma absorção máxima a 550 nm. O teor de Hyp na pele foi finalmente determinado por comparação com a absorvância do padrão Hyp. O conteúdo de colágeno foi calculado de acordo com o conteúdo de Hyp usando um fator de conversão de 8,00 .
2,12. Relação de Colágeno Tipo I a Tipo III
Os kits comerciais de ensaio de colágeno tipo I e tipo III (Nanjing Jiancheng Bio Inst., Nanjing, China) foram usados para analisar o conteúdo relativo de colágeno tipo I e tipo III. A razão de colágeno do tipo I para o tipo III foi calculada de acordo com a seguinte equação: razão de colágeno tipo I para tipo III = conteúdo de colágeno tipo I / conteúdo de colágeno tipo I.
2,13. Análise de Indicadores Antioxidantes
O tecido da pele foi pulverizado num banho de azoto líquido e homogeneizado com 9 pesos de solução salina pré-arrefecida. O homogenato foi centrifugado a 14.000 x g durante 15 min a 4 com uma centruga refrigerada (TGL-185, Pingfan Co., Ltd., Changsha, China) para recolher os sobrenadantes. A concentração total de proteína foi determinada usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Solarbio, Beijing, China). A actividade de SOD, actividade de CAT e malondialdeo MDA (expressos como equivalentes de MDA) foram analisadas utilizando o kit de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) (Nanjing Jiancheng Bio Inst., Nanjing, China) de acordo com as instrues do fabricante e os resultados foram expresso em U / mg de proteína ou nmol / mg de proteína.
2,14. Análise Estatística
Os resultados são expressos pelas médias ± desvio padrão (DP). As comparações entre dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student . As diferenças entre as médias dos grupos individuais foram analisadas usando a análise de variância (ANOVA) com os testes de múltiplas faixas de Duncan. Uma diferença foi considerada estatisticamente significante quando p <0,05. Todos os cálculos foram realizados com o SPSS Statistics 19 (IBM, Chicago, IL, EUA).
3. Resultados
3.1. Caracterização de peptídeos de colágeno
Alcalase e colagenase (duas enzimas otimizadas em nosso estudo anterior) foram usadas para produzir diferentes peptídeos de colágeno (denominados ACP e CCP, respectivamente). As distribuições de pesos moleculares de ACP e CCP são mostradas na Figura 1 . ACP e CCP tiveram uma distribuição de peso molecular semelhante. Tanto ACP como CCP consistiam principalmente em péptidos com um peso molecular superior a <500 Da (mais de 50%), e os péptidos <1000 Da representavam aproximadamente 70% e 74%, respectivamente.
As composições de aminoácidos de ACP e CCP são mostradas na Tabela 1 . ACP e CCP tinham composições de aminoácidos semelhantes. Gly é o aminoácido mais dominante no ACP e no CCP, o que é consistente com a sequência repetitiva do Gly-XY na macromolécula de colágeno. Além disso, ACP e CCP também são ricos em Pro, Glu, Phe, Arg e Thr.
tabela 1
Composições de aminoácidos de peptídeos de colágeno.
| Aminoácido | Conteúdo relativo (g / 100 g) a, b | |
|---|---|---|
| ACP | CCP | |
| Asp | 5,68 | 5,17 |
| Glu | 10,51 | 11,53 |
| Ser | 3,38 | 3,17 |
| Gly | 19,84 | 21,28 |
| Dele | 3,27 | 2,97 |
| Thr | 7,90 | 8,51 |
| Ala | 4,09 | 4,68 |
| Pró | 12,47 | 12,18 |
| Arg | 8,61 | 8,47 |
| Tyr | 2,28 | 1,79 |
| Val | 3,06 | 2,90 |
| Conheceu | 1,79 | 1,27 |
| Cys | 2,39 | 2,08 |
| Ile | 4,11 | 3,93 |
| Leu | 0,70 | 0,08 |
| Phe | 9,31 | 9,36 |
| Lys | 0,61 | 0,62 |
| Total | 100,00 | 100,00 |
a Expressado como g / 100 g de aminoidos totais; b ACP, péptidos de colagénio preparados por Alcalase; CCP, peptídeos de colágeno preparados por colagenase.
3.2. Grau de frouxidão da pele
Como resumido na Tabela 2 , o grau de frouxidão da pele (DSL) do grupo jovem (Y) foi aumentado durante o período experimental, mas significativamente menor do que o grupo modelo (ratos velhos), o que indicou que a flacidez da pele foi aumentada em uma idade dependente maneira. Durante as 8 semanas, o DSL de camundongos nos grupos tratados com CPs (grupos ACP e CCP) diminuiu ao longo do tempo em comparação com o da semana 0. Diferenças significativas no DSL foram observadas entre o grupo ACP-400 e o grupo do modelo correspondente ao tempo na sexta semana ( p <0,05) e o DSL de ACP-400 não apresentaram diferença significativa com o grupo jovem. Além disso, quando o tempo de ingestão oral de ACP foi tão longo quanto 8 semanas, o DSL de todos os grupos alimentados com ACP diminuiu para o nível do grupo jovem ( p> 0,05), e alguns dos grupos (ACP-800 e CCP-400) foram ainda melhores do que o grupo jovem. Da mesma forma, a administração oral de prolina a uma dose de 400 mg / kg de peso corporal também reduziu o DSL com uma diferença significativa observada em comparação com o grupo de modelos de tempo correspondente na semana 8 ( p <0,05).
mesa 2
Grau de frouxidão da pele (DSL) de camundongos cronologicamente envelhecidos após a administração de peptídeos de colágeno por 8 semanas.
| Agrupar a | Grau de frouxidão da pele (DSL, mm) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Semana 0 | Semana 2 | Semana 4 | Semana 6 | 8 semanas | |
| Y | 14,90 ± 2,32 * | 19,15 ± 1,57 * | 19,75 ± 1,03 * | 19,60 ± 0,91 * | 20,40 ± 1,48 * |
| M | 22,25 ± 2,40 | 22,40 ± 1,67 | 23,80 ± 2,25 | 22,50 ± 1,30 | 23,00 ± 1,26 |
| ACP-200 | 23,05 ± 0,56 | 23,50 ± 1,64 | 23,11 ± 1,26 | 22,00 ± 1,31 | 21,22 ± 1,47 * |
| ACP-400 | 22,45 ± 1,88 | 21,55 ± 1,78 | 21,65 ± 1,57 | 20,15 ± 1,34 * | 20,25 ± 1,47 * |
| ACP-800 | 22,30 ± 1,81 | 22,72 ± 2,06 | 22,05 ± 2,26 | 21,60 ± 1,78 | 19,80 ± 0,90 * |
| CCP-400 | 22,40 ± 1,57 | 22,35 ± 1,41 | 21,25 ± 2,03 | 22,10 ± 1,92 | 19,95 ± 1,65 * |
| Pro-400 | 21,65 ± 1,23 | 21,30 ± 2,28 | 22,80 ± 0,81 | 21,70 ± 1,00 | 19,75 ± 1,44 * |
um Y, grupo jovem; M, grupo modelo (grupo antigo); ACP, administrado por péptidos de colagénio que foi preparado por Alcalase; CCP, administrado por peptídeos de colágeno que foi preparado por colagenase; Pro, grupo prolina. 200, 400 e 800 representam doses de administração de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Os valores são mostrados como as médias ± SDs ( n = 10 ratos / grupo). Uma diferença significativa foi observada em * p <0,05 em comparação com o grupo de modelos correspondentes ao tempo.
3.3. Peso Corporal, Índice de Baço (SI) e Índice de Timo (TI)
O peso corporal do grupo jovem foi aumentado durante o período do experimento, enquanto o grupo modelo permaneceu estável ( Tabela 3 ). O tratamento com ACP (200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal), CCP e prolina (400 mg / kg de peso corporal) durante 8 semanas não causou diferenças estatisticamente significativas no peso corporal em comparação com o grupo do modelo não tratado. Além disso, os grupos SI e TI dos grupos ACP, CCP e prolina também não apresentaram diferença significativa em comparação com o grupo modelo. O peso corporal e os índices de órgãos puderam ser medidos para determinar preliminarmente se uma amostra ou dose de amostra tinha efeitos toxicológicos óbvios nos animais . Não houve atrofia óbvia, hiperplasia ou inchaço do baço e timo após a ingestão de CPs e prolina. Com base nestes resultados, concluiu-se que a administração oral de CPs a partir de osso bovino em doses de 200-800 mg / kg de peso corporal, ou prolina a 400 mg / kg de peso corporal por 8 semanas, não teve efeitos toxicológicos óbvios.
Tabela 3
Peso corporal, índice de baço (IS) e índice de timo (IT) de camundongos cronologicamente envelhecidos após a administração de peptídeos de colágeno por 8 semanas.
| Agrupara | Peso Corporal (g) | Índice de baçob (mg / g) | Índice de Timob (mg / g) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Semana 0 | Semana 2 | Semana 4 | Semana 6 | 8 semanas | |||
| Y | 28,28 ± 0,73 | 30,27 ± 1,62 | 31,71 ± 1,30 | 32,63 ± 1,81 | 32,70 ± 1,52 | 3,48 ± 0,69 | 1,82 ± 0,39 |
| M | 47,14 ± 5,39 | 45,55 ± 4,67 | 45,55 ± 4,69 | 46,52 ± 3,40 | 46,33 ± 3,81 | 3,83 ± 1,14 | 1,55 ± 0,53 |
| ACP-200 | 47,41 ± 5,47 | 46,28 ± 6,07 | 46,44 ± 4,41 | 47,41 ± 4,13 | 46,83 ± 3,34 | 3,72 ± 0,06 | 1,71 ± 0,65 |
| ACP-400 | 47,50 ± 5,57 | 46,32 ± 4,91 | 46,90 ± 4,48 | 46,64 ± 4,90 | 46,35 ± 4,90 | 3,24 ± 1,24 | 2,06 ± 0,80 |
| ACP-800 | 47,75 ± 5,67 | 46,88 ± 4,68 | 48,36 ± 7,42 | 49,40 ± 6,63 | 47,39 ± 6,57 | 3,86 ± 1,39 | 1,55 ± 0,62 |
| CCP-400 | 47,92 ± 5,73 | 46,82 ± 4,61 | 48,13 ± 6,55 | 48,84 ± 4,88 | 47,38 ± 4,94 | 3,87 ± 0,94 | 1,62 ± 0,66 |
| Pro-400 | 47,24 ± 5,39 | 46,96 ± 6,14 | 46,32 ± 5,86 | 47,65 ± 5,90 | 47,44 ± 5,69 | 3,64 ± 1,04 | 2,02 ± 0,86 |
um Y, grupo jovem; M, grupo modelo (grupo antigo); ACP, administrado por péptidos de colagénio que foi preparado por Alcalase; CCP, administrado por peptídeos de colágeno que foi preparado por colagenase; Pro, grupo prolina. 200, 400 e 800 representam doses de administração de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Os valores são mostrados como as médias ± SDs ( n = 10 ratos / grupo). Não houve diferença significativa entre cada grupo de administração e grupo modelo de tempo correspondente ( p > 0,05). b Indica valores na semana 8.
3.4. Histologia da pele
Os resultados do exame morfológico da pele dorsal dos camundongos estão ilustrados na Figura 2. As fibras de colágeno da pele na derme foram coradas em vermelho claro com hematoxilina-eosina (HE). No grupo modelo (camundongos velhos), mais vermelho e mais espaço (seta verde) foram observados no tecido da derme do que os do grupo jovem. Havia derme mais fina e menos glândula sebácea (seta vermelha) no grupo modelo em comparação com o grupo jovem. Após a ingestão de ACP e PCC, o espaço no tecido da derme foi diminuído e as fibras pareciam ser mais densas e mais organizadas em comparação com o grupo modelo. Além disso, o número de glândulas sebáceas aumentou quando tratados por ACP, especialmente na dose de 800 mg / kg de peso corporal. Estes resultados indicaram que o ACP melhorou as fibras de colagénio envelhecidas na derme da pele de uma maneira dependente da dose. Da mesma forma, o escasso, fragmentado,
Imagens representativas da secção da pele dorsal corada com hematoxilina-eosina (HE) de todos os grupos, Y, grupo jovem; M, grupo modelo (grupo antigo); ACP, administrado por péptidos de colagénio que foi preparado por Alcalase; CCP, administrado por peptídeos de colágeno que foi preparado por colagenase; Pro, grupo prolina. 200, 400 e 800 representam doses de administração de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal, respectivamente. As glândulas sebáceas e o espaço no tecido da derme são mostrados como setas vermelhas e setas verdes, respectivamente. Barras de escala, 100 μm.
3.5. Componentes da pele
Os resultados de umidade da pele, ácido hialurônico (HA), conteúdo de colágeno e razão de colágeno do tipo I para o tipo III são mostrados na Figura 3 A – D. O teor de umidade da pele e a proporção de colágeno tipo I para o tipo III no grupo modelo (ratos idosos) foram significativamente menores do que no grupo jovem (todos p<0,05), indicando que o teor de umidade da pele e a proporção de colágeno tipo I para o tipo III diminuíram com a idade. Os teores de HA e colágeno na pele também foram menores do que no grupo jovem, embora não tenha havido diferença significativa em comparação com o grupo modelo. A ingestão de CPs (ACP e CCP) e prolina não teve efeito significativo na umidade da pele e no conteúdo de AH em comparação com o grupo modelo. Em contraste, a administração oral de ACP (200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal) causou um aumento dependente da dose no conteúdo de colágeno, e houve uma diferença significativa no conteúdo de colágeno entre o grupo que recebeu 800 mg / kg de ACP e o grupo modelo (p <0,05). A ingestão de PCC na dose de 400 mg / kg de peso corporal também aumentou o conteúdo de colágeno na pele ( p<0,05 vs. o grupo de modelos). No entanto, a ingestão de prolina na dose de 400 mg / kg de peso corporal não teve efeito significativo sobre o conteúdo de colágeno em comparação com o grupo modelo. Um aumento dose-dependente também foi observado para a proporção de colágeno do tipo I para o tipo III nos grupos ACP-alimentados, e houve diferenças significativas entre os grupos que receberam 400 e 800 mg / kg de ACP e o grupo modelo (todos p <0,05 ); enquanto a ingestão de PCC na dose de 400 mg / kg de peso corporal não teve efeito significativo na relação de colágeno tipo I para o tipo III em comparação com o grupo modelo. A administração oral de prolina também aumentou significativamente a proporção de colágeno tipo I para o tipo III na pele ( p <0,05 vs. o grupo modelo).
Figura 3
Conteúdo de umidade ( A ), conteúdo de ácido hialurônico ( B ), conteúdo de hidroxiprolina ( C ) e razão de colágeno tipo I para tipo III ( D ) de camundongos cronologicamente envelhecidos após a administração de peptídeos de colágeno por 8 semanas. Y, grupo jovem; M, grupo modelo (grupo antigo); ACP, administrado por péptidos de colagénio que foi preparado por Alcalase; CCP, administrado por peptídeos de colágeno que foi preparado por colagenase; Pro, grupo prolina. 200, 400 e 800 representam doses de administração de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Os valores são mostrados como as médias ± SDs ( n = 10 ratos / grupo). Uma diferença significativa foi observada em * p <0,05 em comparação com o grupo de modelos correspondentes ao tempo.
3.6. Indicadores antioxidantes
O teor de superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e malondialdeído (MDA) na pele são mostrados na Tabela 4 . As atividades de SOD e CAT no grupo M foram significativamente menores na pele em comparação ao grupo Y ( p <0,05); enquanto o nível de MDA no grupo modelo foi maior que no grupo jovem ( p <0,05). A administração oral de CPs (ACP e CCP) aumentou significativamente as atividades de SOD e CAT e reduziu o nível de MDA (todos p<0,05 vs. o grupo modelo). Além disso, o aumento das atividades de SOD e CAT e a diminuição do nível de MDA nos grupos alimentados com ACP mostraram uma maneira dependente da dose. Em contraste, a ingestão de prolina não teve efeito significativo sobre esses três indicadores antioxidantes.
Tabela 4
Atividades de SOD e CAT e conteúdo de MDA na pele dorsal de camundongos cronologicamente envelhecidos após a administração de peptídeos de colágeno por 8 semanas.
| Agrupara | SOD (U / mg de proteína) | CAT (U / mg de proteína) | Equivalentes de MDA (nmol / mg de proteína) |
|---|---|---|---|
| Y | 36,594 ± 1,142 * | 10,412 ± 1,143 * | 2,209 ± 0,278 * |
| M | 26,877 ± 3,880 | 4,650 ± 1,582 | 3,135 ± 0,302 |
| ACP-200 | 38,746 ± 0,753 * | 8,324 ± 0,890 * | 2,347 ± 0,209 * |
| ACP-400 | 39,823 ± 3,410 * | 11,327 ± 1,096 * | 2,261 ± 0,107 * |
| ACP-800 | 40,036 ± 4,820 * | 12,012 ± 0,752 * | 2,154 ± 0,325 * |
| CCP-400 | 39,796 ± 1,211 * | 9,354 ± 1,856 * | 2,204 ± 0,201 * |
| Pro-400 | 32,646 ± 1,691 | 3,318 ± 0,665 | 2,456 ± 0,316 |
um Y, grupo jovem; M, grupo modelo (grupo antigo); ACP, administrado por péptidos de colagénio que foi preparado por Alcalase; CCP, administrado por peptídeos de colágeno que foi preparado pela colagenase. Pro, grupo prolina. 200, 400 e 800 representam doses de administração de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Os valores são mostrados como as médias ± SDs ( n = 10 ratos / grupo). Uma diferença significativa foi observada em * p <0,05 em comparação com o grupo de modelos correspondentes ao tempo.
4. Discussão
O envelhecimento da pele consiste em envelhecimento cronológico e fotoenvelhecimento. Existem algumas diferenças nos sinais clínicos e mecanismos subjacentes para esses dois processos . Peptídeos de colágeno (CPs) têm sido amplamente relatados para exercer efeitos benéficos sobre o fotoenvelhecimento cutâneo, mas poucos estudos foram realizados para avaliar seu efeito na pele envelhecida cronologicamente. No presente estudo, camundongos Kunming de 13 meses de idade, equivalentes a 45 anos de vida humana , foram empregados para investigar o efeito de CPs em pele envelhecida cronologicamente. Em vários ensaios clínicos anteriores, uma dose diária de 2,5 g ou 5 g de PCs foi empregada em indivíduos adultos, e essas doses foram consideradas seguras. De acordo com a conversão de doses de animais em dose equivalente humana (HED) com base na área de superfície corporal (BSA), uma dose diária de 500 ou 1000 mg / kg de peso corporal poderia ser usada em camundongos. Além disso, doses diárias de 50 a 200 mg / kg de peso corporal também foram usadas em vários experimentos em animais . Portanto, doses de 200, 400 e 800 mg / kg de peso corporal / dia foram empregadas no presente estudo.
A frouxidão da pele é uma característica principal do envelhecimento natural da pele e aumenta com a idade . Portanto, a flacidez da pele foi avaliada dinamicamente através da medição do grau de flacidez da pele (DSL) para observar o efeito da ingestão de CPs na pele envelhecida cronologicamente. Um óbvio efeito benéfico foi observado após 8 semanas de ingestão de CPs. Portanto, os camundongos foram sacrificados e as amostras foram coletadas para posterior tratamento e análise após 8 semanas. Inesperadamente, a ingestão de prolina (abundante em colágeno) também melhorou significativamente a flacidez da pele. Estes resultados forneceram orientações para a aplicação de CPs ou prolina contra o envelhecimento cronológico da pele. A duração de 8 semanas da ingestão de CPs pode ser equivalente a vários anos de vida humana em termos de tempo de vida. Mas isso não significa que os efeitos benéficos dos CPs pudessem ser observados somente após vários anos de duração da ingestão de CPs,.
Como o principal componente da pele derme, o colágeno tem sido relatado como benéfico para melhorar a flacidez da pele e diminuir o aparecimento de rugas, e sua redução na quantidade e qualidade é uma das principais causas de frouxidão e rugas . Na pele cronologicamente envelhecida, a fibra de colágeno dérmico tornou-se esparsa, fragmentada e desorganizada . No entanto, a ingestão de CPs (ACP e CCP) reparou as fibras de colágeno e as fibras pareciam mais densas e organizadas em comparação com a pele envelhecida. Colágeno na pele consiste principalmente de colágeno tipo I e tipo III. A produção de colágeno e a proporção de colágeno tipo I para o tipo III diminui gradualmente com a idade. O colágeno tipo I tende a formar feixes mais largos de fibras, enquanto o colágeno tipo III forma feixes estreitos. A diminuição do diâmetro e do número de feixes de colágeno está correlacionada com a diminuição da carga e da força de tração relatada no envelhecimento da pele . A administração oral de CPs aumentou o conteúdo de colágeno e a proporção de colágeno tipo I para o tipo III de maneira dose-dependente, sugerindo que os CPs melhoraram a frouxidão da pele ao alterar quantitativamente e qualitativamente o colágeno da pele. Em contraste, a umidade da pele e o ácido hialurônico (AH) não foram afetados pela ingestão de CPs. A HA é uma molécula-chave envolvida na umidade da pele, porque possui uma capacidade única de ligar e reter moléculas de água . Em conjunto com os resultados do presente estudo, concluiu-se que a administração oral de CPs teve efeito benéfico sobre a pele envelhecida cronologicamente, melhorando a flacidez da pele, mas não teve influência na retenção de umidade da pele.
Interessantemente, a ingestão de prolina também teve efeito benéfico sobre a pele cronologicamente envelhecida em termos de flacidez da pele, conteúdo de colágeno e proporção de colágeno do tipo I para o tipo III. Este resultado do estudo in vivo foi consistente com o de um experimento prévio in vitro que demonstrou que a prolina poderia aumentar a síntese de colágeno de fibroblastos confluentes, mas não estimulou a proliferação de fibroblastos . Watanabe-Kamiyama e colaboradores informaram que a prolina pode atingir a pele após a ingestão de prolina . Portanto, especulamos que a ingestão de prolina exerceu efeito benéfico sobre a pele envelhecida cronologicamente, aumentando a síntese de colágeno dos fibroblastos da pele.
Tem sido amplamente aceito que o estresse oxidativo desempenha um papel crítico no início e na condução dos eventos de sinalização que resultam no envelhecimento da pele. Estudo relatou que a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi aumentada em pele envelhecida e cronologicamente envelhecida . Além de atacar diretamente as macromoléculas, como proteínas, lipídios, DNA e RNA, as ROS excessivas também iniciam várias vias de sinalização, incluindo proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs) e fator nuclear potenciador da cadeia leve kappa das células B ativadas ( NF-κB), além de ativar a proteína ativadora do fator de transcrição-1 (AP-1) . O AP-1 induz a degradação do colágeno pela regulação positiva de enzimas degradadas pelo colágeno, como a metaloproteinase de matriz (MMP) -1, MMP-3 e MMP-9 e a regulação negativa da biossíntese de colágeno. Estas alterações na pele levam ao fenótipo da pele envelhecida. Portanto, antioxidantes ou sequestradores de radicais livres, como o ácido ascórbico e os polifenóis foram relatados para melhorar o envelhecimento da pele, eliminando o excesso de EROs. Normalmente, as enzimas antioxidantes endógenas são capazes de eliminar as ROS excessivas para proteger os tecidos da pele contra lesões oxidativas. SOD e CAT são duas enzimas antioxidantes que inativam os ânions superóxido e o peróxido de hidrogênio, respectivamente. O MDA é um produto da peroxidação lipídica e é geralmente quantificado para estimar a extensão da peroxidação lipídica induzida pelas EROs. As atividades de SOD e CAT diminuíram e o conteúdo de MDA aumentou com a idade. No entanto, a ingestão de CPs (ACP e CCP) poderia aumentar as atividades de SOD e CAT e diminuir o conteúdo de MDA, indicando que a ingestão de peptídeos de colágeno do osso bovino teve a capacidade de diminuir as ROS na pele. A diminuição das ROS na pele pode ajudar a aumentar a biossíntese de colágeno e diminuir a degradação do colágeno, reduzindo a produção de MMPs. De fato, vários estudos anteriores relataram que a ingestão de hidrolisado de colágeno poderia aumentar a expressão de colágeno na pele e suprimir MMP-1 e MMP-2 . Estudos in vitro demonstraram que os ACP e CCP possuíam alta capacidade antioxidante com base nos radicais hidroxila e ensaios de sequestro ABTS + (dados não mostrados). Além disso, tem sido amplamente relatado que a via do elemento de resposta antioxidante (ARE) relacionada ao fator 2 relacionado ao fator E2 (Nrf2) nuclear desempenha um papel central na regulação de enzimas antioxidantes contra o estresse oxidativo. Portanto, especulamos que os CPs exerceram seu efeito antioxidante de forma direta e / ou indireta. Também é possível que os CPs tenham exercido seus efeitos benéficos sobre a pele envelhecida cronologicamente de outras formas, já que estudos anteriores relataram que o Pro-Hyp no sangue humano após a ingestão oral de CPs estimula o crescimento de fibroblastos . Deve-se notar que a ingestão de prolina não teve um efeito óbvio na capacidade antioxidante da pele. Esses resultados sugerem que os CPs têm mecanismos de ação mais complexos subjacentes ao efeito antienvelhecimento do que a prolina.
O osso bovino é uma fonte abundante de gelatina. Os CPs do osso bovino concentram-se principalmente no seu efeito benéfico no metabolismo ósseo. No entanto, o presente estudo constatou que os CPs do osso bovino também tiveram efeito benéfico no envelhecimento da pele. Os CPs preparados neste estudo consistem principalmente em oligopéptidos (<1000 Da). Foi relatado que pequenos peptídeos, especialmente os di-e tripeptídeos, são mais facilmente absorvidos no trato intestinal do que moléculas maiores, e oligopeptídeos são mais bioativos do que proteínas, polipeptídeos e aminoácidos livres . Portanto, nós especulamos que ACP e PCC são prontamente absorvidos e podem exibir efeitos biológicos potenciais, uma vez que são administrados por via oral. Outro objetivo deste estudo é investigar preliminarmente se diferentes CPs preparados por Alcalase e colagenase têm diferentes efeitos na pele envelhecida cronologicamente. Com base nos resultados atuais, pode-se dizer que os efeitos benéficos da ACP foram ligeiramente melhores que os da PCC. Portanto, Alcalase é uma enzima favorável para produzir CPs com efeitos benéficos sobre o envelhecimento da pele em indústrias alimentícias e médicas. O presente resultado da distribuição do peso molecular fornece um guia para testar e controlar a qualidade dos CPs. Além disso, os CPs devem ser protegidos do oxigênio e da luz por causa de sua fácil oxidação.
5. Conclusões
Em resumo, o presente estudo demonstrou que a administração oral de peptídeos de colágeno do osso bovino poderia melhorar a flacidez da pele cronologicamente envelhecida, aumentando o conteúdo de colágeno e a proporção de colágeno tipo I para o tipo III, mas não teve efeito na retenção de umidade da pele. Os efeitos benéficos dos peptídeos de colágeno preparados pela Alcalase (ACP) foram ligeiramente melhores que os dos peptídeos de colágeno preparados pela colagenase (CCP). Outro mecanismo de ação subjacente aos efeitos benéficos sobre a pele envelhecida dos peptídeos de colágeno pode estar envolvido no aumento das propriedades antioxidantes no organismo. A ingestão de prolina também melhorou a frouxidão da pele envelhecida cronologicamente, mas não afetou a capacidade antioxidante da pele.
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